北京協(xié)和醫(yī)院近期發(fā)布了《新型冠狀病毒核酸檢測》標(biāo)準(zhǔn)操作流程。這為我們建設(shè)2019-nCov新型冠狀病毒P3實驗室建設(shè)提供了科學(xué)指導(dǎo)。
PCR實驗室設(shè)備一站式采購 152——2136——9228
具體檢測流程如下
一、核酸檢測前的生物安全防護(hù)（工作人員個人三級防護(hù)的穿戴）
1、穿戴流程：
在基因擴(kuò)增實驗室的清潔區(qū)（更衣區(qū)）或者普通實驗室的潔凈區(qū)，工作人員按順序依次穿戴好一次性帽子、醫(yī)用N95口罩、一次性防護(hù)服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防護(hù)目鏡和雙層乳膠手套，進(jìn)入樣本處理工作區(qū)域或?qū)嶒炇摇?/p>
2、要點提示：
2.1、具備標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增布局條件的實驗室，應(yīng)在清潔更衣區(qū)做好個人三級防護(hù)，條件有限的實驗室亦可選擇在一潔凈的實驗室中按流程穿戴好個人三級防護(hù)。
2.2、需佩戴醫(yī)用N95口罩，若無醫(yī)用N95口罩，可以考慮用普通N95/KN95口罩外加一次性外科口罩的組合方式，但不要佩戴有呼吸閥的N95口罩。
2.3、佩戴N95口罩時需檢查密閉性，通過雙手按壓、深呼吸、左右轉(zhuǎn)頭等動作嚴(yán)格檢查口罩是否佩戴正確。
2.4、一次性防護(hù)服已具備新型冠狀病毒核酸檢測的防護(hù)需求，有條件時可以考慮加穿一次性反穿隔離衣，穿衣時需由他人協(xié)助。
2.5、穿戴整齊的工作人員，應(yīng)按要求盡快進(jìn)入樣本處理的實驗區(qū)域開展工作，嚴(yán)禁穿戴三級防護(hù)后再進(jìn)入普通實驗區(qū)域或辦公區(qū)域。
二、樣本的滅活處理
1、操作流程：
兩名完成三級防護(hù)的工作人員，進(jìn)入樣本處理區(qū)或樣本處理實驗室，將接收到的樣本二級包裝在安全柜內(nèi)打開，檢查樣本主容器是否為嚴(yán)格密閉；對密封袋表面進(jìn)行消毒后，對送檢樣本進(jìn)行56℃下30分鐘的滅活，滅活后的樣本管需在生物安全柜內(nèi)打開內(nèi)層的容器，將拭子保存液混勻后進(jìn)行分裝和用于核酸提取。
2、要點提示：
2.1、涉及高致病性病原微生物的實驗室活動，需由兩名工作人員完成，其中一人負(fù)責(zé)主要實驗操作，一人提供必要的協(xié)助。主操作者應(yīng)避免反復(fù)多次進(jìn)出安全柜。
2.2、滅活形式：可以采用水浴或空氣加熱形式完成滅活，采用空氣加熱時可適當(dāng)延長滅活時間。有條件時可以采用小型化設(shè)備在安全柜內(nèi)操作，減少樣本進(jìn)出安全柜的次數(shù)。滅活前的樣本嚴(yán)禁在生物安全柜外打開和操作。
2.3、應(yīng)特別檢查采樣管是否擰緊、有無樣本溢漏等情況。
2.4、樣本管每次進(jìn)出安全柜均需對外表面進(jìn)行消毒。
2.5、應(yīng)就近配備適量的消毒處理物品，以防止實驗操作過程中可能發(fā)生的意外溢灑事故，有條件時建議在安全柜內(nèi)配備一次性吸水臺布。
三、樣本的核酸提取
1、手工核酸提取操作流程（以凱杰的52906柱提法核酸提取試劑盒為例）
1.1、裂解液配制：在基因擴(kuò)增實驗室的試劑配制區(qū)或單獨的普通試劑配制實驗室中，準(zhǔn)備核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分別向洗液1和洗液2中加入分子生物學(xué)級別的130ml和160ml的無水乙醇并及時做好標(biāo)記；取310μl洗脫液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通過傳遞窗進(jìn)入核酸提取區(qū)或由工作人員送入核酸提取實驗室。
1.2、樣本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml無菌EP管中，加入5、6μl配制好的Carrier RNA，再加入已經(jīng)滅活的140μl樣本（例如咽拭子、血漿等），混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鐘，充分裂解樣本中的核酸。將EP管瞬時離心后加入560μl無水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時離心后備用。吸取630μl裂解產(chǎn)物，小心加入至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘，轉(zhuǎn)移離心柱至新收集管，將剩余630μl裂解產(chǎn)物加到離心柱中，重復(fù)上一離心操作（若樣本體積大于140μl，則在此步驟重復(fù)將630μl裂解產(chǎn)物過濾收集在一個離心柱上）。
1.3、核酸的洗滌：取500μl洗液1（AW1）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，用14000rpm（或20000g）離心3分鐘，去除洗液2（AW2）；換新收集管后，繼續(xù)用離心機(jī)大轉(zhuǎn)速（20000g）離心1分鐘，充分甩離殘留的洗液2（AW2）。
1.4、核酸的洗脫和回收：取一1、5ml無菌EP管，將離心柱放入其中，加入洗脫液（AVE）40~60μl，室溫靜置1分鐘后，用8000rpm離心1分鐘回收核酸，以備PCR檢測使用。
1.5、要點提示：
?。?）、新鮮裂解液的配制應(yīng)盡可能在專門的潔凈區(qū)域或單獨的實驗室進(jìn)行。
?。?）、要用分子生物學(xué)級別的無水乙醇試劑進(jìn)行配制。
（3）、向離心柱中加入裂解產(chǎn)物、洗液時操作要非常小心，盡量將洗頭下探到離心柱內(nèi)部后靠管壁加樣，切忌出現(xiàn)溢灑后污染到離心柱的密封圈，這可能會導(dǎo)致乙醇?xì)埩?，抑制后續(xù)PCR反應(yīng)。
?。?）、從離心機(jī)中取出離心柱時應(yīng)小心操作，避免離心柱下緣被收集管中的濾過殘液污染。
?。?）、加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速離心非常關(guān)鍵，能幫助充分甩離離心柱濾膜中殘留的洗液2殘液，確保洗脫核酸的純度。
?。?）、洗脫液加樣時需小心操作，確保洗脫液盡可能覆蓋全部離心柱濾膜，充分洗脫核酸，提高核酸提取的產(chǎn)量。
?。?）、手工核酸提取可優(yōu)選使用檢測試劑盒說明書推薦的配套手工提取試劑，也可選用通用手工提取試劑。
?。?）、樣本處理過程中，工作人員覺得有必要時，應(yīng)隨時更換新的外層乳膠手套。
2、采用核酸提取儀提取核酸的操作流程
根據(jù)核酸提取儀和試劑的說明書準(zhǔn)備好提取試劑，取200μl樣本上機(jī)提取核酸，并按照要求回收提取好的核酸備用。
要點提示：
1、不同的提取儀器和試劑的提取效率可能存在差異，請一定嚴(yán)格按照提取試劑盒的說明書進(jìn)行核酸提取操作。
2、有條件時可以考慮配備小型化的核酸提取儀在安全柜內(nèi)使用，以進(jìn)一步加強生物安全防護(hù)；若使用在安全柜外的核酸提取儀，則一定要做好生物安全防護(hù)及樣本的防污染保護(hù)。
四、PCR體系的配制和模板加樣
1、操作流程：
在基因擴(kuò)增實驗室的試劑配制區(qū)或單獨的實驗室，配制PCR體系。根據(jù)試劑盒說明書的要求，將試劑盒的不同組分（一般包括反應(yīng)液、酶、引物等）按照各自必須的體積量進(jìn)行配制混合，充分混勻并離心后，通過傳遞窗傳遞到核酸提取和加樣區(qū)，或由專人從試劑配制實驗室送至核酸提取和加樣實驗室。在加樣生物安全柜內(nèi)，根據(jù)檢測樣本例數(shù)分裝體系到每個反應(yīng)管中，逐一將樣本核酸加入到對應(yīng)的反應(yīng)管中，并加蓋密閉好PCR反應(yīng)管；每批次檢測需要做一個陽性對照和3個陰性對照。
2、要點提示：
?。?）、試劑配制必須嚴(yán)格在試劑配制區(qū)或單獨、潔凈的實驗室和安全柜內(nèi)進(jìn)行，以確保試劑不會有被污染的可能。
?。?）、試劑配制時要根據(jù)檢測樣本數(shù)量進(jìn)行合理配制，每批次檢測均需要包括3個陰性對照和1個陽性對照的試劑，同時還需要考慮試劑分配過程中的正常損耗等消耗。
?。?）、加樣可以和樣本處理/核酸提取在同一分區(qū)或同一間實驗室進(jìn)行，但如有條件好在單獨的加樣區(qū)或至少使用安全柜進(jìn)行加樣。
?。?）、體系分裝建議每次更換新的吸頭，避免反復(fù)使用帶來體積誤差和交叉污染。
（5）、應(yīng)配置體系加樣登記表，確保加樣過程準(zhǔn)確無誤。
（6）、PCR密閉管蓋應(yīng)特別謹(jǐn)慎，建議更換新的手套，防止手套等接觸管蓋內(nèi)部帶入污染的風(fēng)險。
五、上機(jī)檢測及結(jié)果分析
1、操作流程：
在擴(kuò)增區(qū)或擴(kuò)增實驗室，由專人取出配制好的PCR檢測管，混勻、離心后，小心上機(jī)檢測，按照試劑盒說明書設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)并分析判讀結(jié)果。進(jìn)行結(jié)果分析時，應(yīng)認(rèn)真閱讀試劑盒說明書，在了解該試劑盒的靈敏度、檢測方法和局限性等技術(shù)特點的基礎(chǔ)上，結(jié)合該批次陰性質(zhì)控的結(jié)果，綜合判讀樣本的檢測結(jié)果。檢測結(jié)束后，為防止可能的擴(kuò)增污染，擴(kuò)增結(jié)束后的PCR管嚴(yán)禁開蓋或帶離擴(kuò)增實驗室，應(yīng)盡快通過可密封塑料袋等容器盛裝密閉后，放入醫(yī)療垃圾桶中做進(jìn)一步處理。
2、要點提示：
?。?）、因基因擴(kuò)增區(qū)存在污染的風(fēng)險，應(yīng)設(shè)專門的擴(kuò)增區(qū)域或在單獨的實驗室進(jìn)行擴(kuò)增，必須和核酸提取、試劑配制區(qū)域有嚴(yán)格的物理分割。
?。?）、不同操作區(qū)域的工作服不要混穿，特別是基因擴(kuò)增區(qū)的工作服，建議僅在擴(kuò)增區(qū)域或擴(kuò)增實驗室內(nèi)使用。
?。?）、熟悉檢測用PCR儀器的基本性能和特點，能客觀分析判斷檢測結(jié)果。
六、檢測后的消毒處理
1、操作流程：
?。?）、生物安全柜內(nèi)：在完成樣本核酸提取后，應(yīng)在安全柜內(nèi)用75%消毒酒精對外層手套進(jìn)行消毒處理，并將外層手套取下后棄至安全柜內(nèi)的垃圾桶中。小心收納并丟棄使用過的一次性吸水臺布，用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精擦拭安全柜臺面、移液器等安全柜內(nèi)全部儀器的表面。將安全柜內(nèi)產(chǎn)生的新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療垃圾經(jīng)3層包裝后，轉(zhuǎn)移至實驗室的醫(yī)療垃圾桶中。開啟紫外燈照射生物安全柜，時間應(yīng)大于30分鐘。
?。?）、樣本核酸提取工作人員實驗室內(nèi)：他人協(xié)助用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精均勻噴灑內(nèi)層手套、袖口、手臂及隔離衣后，將外層反穿隔離衣脫下至新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾桶中送高壓處理。
?。?）、樣本處理實驗室內(nèi)：用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精消毒實驗室臺面和地面；開紫外燈進(jìn)行大于30分鐘的空間消毒。
?。?）、工作人員摘脫三級防護(hù)：在緩沖區(qū)戴新的外層手套，摘護(hù)目鏡置于75%酒精浸泡消毒，從頭開始，自上而下、由內(nèi)而外緩慢翻轉(zhuǎn)脫下一次性防護(hù)服，直到將一次性防水靴套全部脫下，將防護(hù)服置于新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾桶中送高壓處理。摘口罩、帽子、內(nèi)層鞋套和內(nèi)層手套后同樣置于新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾桶中送高壓處理。
（5）、新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療垃圾：所有新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療垃圾均需經(jīng)濕熱高壓滅菌后再作為普通醫(yī)療垃圾處理，且垃圾袋上應(yīng)標(biāo)注新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾的相關(guān)信息。高壓處理前后的垃圾要嚴(yán)格區(qū)分，在高壓滅菌區(qū)域?qū)π滦凸跔畈《踞t(yī)療垃圾進(jìn)行濕熱高壓滅菌處理，高壓參數(shù)為121℃、30分鐘。高壓要做物理、生物指示，以確保高壓滅菌的效果。
2、要點提示：
?。?）、生物安全柜內(nèi)是風(fēng)險高區(qū)域，操作者的外層手套經(jīng)消毒后必須脫在安全柜內(nèi)。
?。?）、靴套或鞋套的主要作用是對操作者的腳和腿部進(jìn)行防護(hù)，要求必須防水，以確保在實驗室內(nèi)發(fā)生意外遺灑時可隔離污染。
?。?）、核酸提取儀內(nèi)部、生物安全柜內(nèi)部和實驗室空間均應(yīng)進(jìn)行紫外線消毒，但紫外線對空氣的消毒效果好，對物體表面的消毒效果隨距離變遠(yuǎn)而減弱，故在紫外線消毒前，仍需對各種儀器表面、臺面、地面用消毒劑進(jìn)行擦拭消毒。
?。?）、工作人員在摘脫個人三級防護(hù)后，仍應(yīng)參照實驗室原有實驗后操作流程進(jìn)行嚴(yán)格認(rèn)真的常規(guī)消毒處理，特別是實驗后的手衛(wèi)生環(huán)節(jié)。
PCR實驗室設(shè)備 152——2136——9228
